대상 - 단파장 가시광의 단백질 S-nitrosylation 조절을 통한 피부 면역 억제 신규기전

표피는 피부의 가장 바깥쪽에 위치하며 외부환경과 직접 접촉하는 부위로, 피부의 수분 증발을 막거나, 외부의 유해인자로부터 인체를 보호하는 장벽의 역할을 수행 한다.

특히, 외부 미생물 등으로부터 피부를 보호하는 선천적 면역기능이나 태양광선으로부터의 방어기능 등을 수행하고 있다.

본 연구에서는 표피에 상시로 노출될 수 있는 여러 가시광 파장영역대의 각각의 광원 (410, 457, 505, 530, 590, 660 nm) 들을 이용하여 각 파장대별 빛의 영향에 대한 분자생물학적 연구를 수행하였다. 특히 아직까지 잘 규명되지 않은 가시광선에 의한 '피부장벽' 및 '면역기능‘의 변화 연구를 각질형성세포를 포함한 3D 인공피부를 이용하여 연구하였다.

가시광선이 미치는 표피의 면역관련 인자의 변화와 기전에 관해 연구한 결과, 흥미롭게도 단파장의 가시광선 영역 (lmax: 410 및 457 nm)에 의해서 선천 면역인자인 Antimicrobial peptides (AMPs)의 발현이 현저히 감소하였으며, 그와 반대로 UVB에 의해서는 증가하는 AMPs가 많았다 (Fig. 1). 또한 단파장 가시광선 영역은 특정 Cytokines 및 Chemokines (RANTES, MCP-1, IL-8)의 발현을 억제하고 있음을 알 수 있었다 (Fig. 2).

그리고 피부면역과 관련된 Toll like receptor (TLR) 의 다양한 Ligands를 이용한 AMPs류의 발현증가는 단파장 가시광에 의해 현저히 감소되며, 또한 Inflammation과 관련한 NF-kB 의 인산화 및 핵으로의 이동이 감소되는 것을 확인함으로써 NF-kB signal pathway에도 변화가 생기는 것을 확인할 수 있었다. 단파장 가시광의 파장에서 UVA (lmax: 365 nm)를 완전히 배제하진 못하지만 두 파장의 NF-kB signal의 효과가 각각 다르기에 단파장 가시광에 의한 결과로 판단 할 수 있었다 (Fig. 3).

더 나아가 이러한 현상의 원인은 단파장 가시광이 세포 내 미미한 NO의 증가를 유도하지만, 이러한 NO의 변화로 인해 일어나는 현상인지 알아보기 위해 NO scavenger 이자 대표적인 S-nitrosylation의 inhibitor인 c-PTIO (2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-l-oxyl-3-oxide)를 이용하여 실험한 결과 ROS scavenger인 N-acetyl-l-cysteine (NAC)에 의해서는 효과가 미미하였으나 c-PTIO에서는 단파장 가시광에 의한 효과를 현저하게 억제하였다 (Fig. 4). 또한 NOS (nitric oxide synthase)에 의한 관련성을 확인하기 위해 NOS inhibitor인 L-NNA (N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoicacid)를 통해서 검증한 결과 NOS에 의한 NO 생성과는 관련이 없었다 (data not shown).

또한 NO의 soluble guanylyl cyclase를 통한 cGMP 활성으로 인한 PKG signaling pathway의 영향 유무를 확인하기 위해 선택적이고 비가역적인 sGC inhibitor, ODQ (1H-(1,2,4) oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one)를 이용하여 단파장 가시광의 억제 효과를 확인한 결과 연관성이 거의 없었다(data not shown).

이와 같은 결과를 토대로, 본 현상은 ROS가 아닌 NO와 깊은 연관관계가 있으며 많은 ROS나NO의 생성 자체보다는 S-nitrosylation에 무게를 더 둘 수 있었다. 그래서 단파장 가시광에 의한 SNO단백질(S-nitrosylation Protein)의 변화를 Biotin switch assay를 통해서 SNO단백질들만 분리하여 Silver staining으로 확인한 결과, 가시광선 중 단파장 가시광에 의해서만 가장 많은 SNO 단백질들이 변화함을 확인할 수 있었고, 또한 단파장 가시광 노출 후 시간이 지남에 따라 SNO 단백질들의 양이 각기 다르게 변화함을 확인 할 수 있었다 (Figure 5a, 5b). 이러한 SNO단백질들을 LC MS/MS 분석을 통해 동정하였고, 확인 결과 이중 면역에 관련하고 있는 많은 단백질들의 SNO 상태가 변화하고 있음을 알 수 있었다.

즉 가시광선에 의해서 어떤 단백질들은 NO가 방출되고 (NO-donor), 또 다른 단백질들에서는 SNO가 더욱 증가 (NO-acceptor)하고 있었다. 하지만 Red 파장 영역 (lmax 660 nm)에서는 이러한 변화가 거의 관찰되지 않았다.

이러한 결과를 종합해보면, 가시광선 중 가장 짧은 파장 영역인 Blue Light 영역이 단백질들의 non-enzymatic nitric oxide (NO) formation을 형성하여 결과적으로 NO를 특정 면역관련 단백질로의 redistribution (재분배)을 유도하고 있는 것을 알 수 있었다 (Figure 5c).

또한 TLR signaling cascade에서 중요한 단백질들의 SNO 상태를 확인한 결과 TRIF, myd88, NF-kB에서 시간에 따라 SNO가 점차 증가하고 있었다 (Figure 5d). 이는 특정 단백질들의 S-nitrosylation 이 면역관련 단백질의 활성을 억제한다는 기존의 보고와 일치하는 결과이다.

그리고 본 SNO 단백질의 NO 재분배의 억제가 단파장 가시광의 효과를 현저히 억제하는지 확인하기 위해 각질형성세포를 이용하여, c-PTIO를 처리하여 살펴본 결과, 단파장 가시광 조사 후 시간에 따른 SNO 단백질의 양의 변화가 급격하게 줄어들었으며 또한 이를 3D 인공피부에서 확인한 결과 단파장 가시광에 의해 나타나던 면역인자들의 감소가 더 이상 보이지 않았다 (Figure 5c).

결과적으로 단파장 가시광의 노출에 따라 TLR signaling molecules 및 면역에 관련한 많은 단백질들의 S-nitrosylation 상태가 변화하고, 결국 이로 인해 면역인자들의 억제가 이루지는 신규 기전을 규명할 수 있었다.

본 연구는 단파장 가시광선이 피부 단백질의 전사 후 변형 (post-translational modification)의 일종인 S-nitrosylation를 유도하고 이를 통해 면역인자들을 조절한다는 기전을 새롭게 제시 한다는 점에서 의의를 찾을 수 있으며 외부환경의 단파장 가시광선의 중, 장기 노출 시 정상피부의 면역인자들의 활성 억제를 초래할 수 있음을 암시하고 있다. 또한 반대급부적으로는 인류의 큰 고통인 염증성 피부질병을 완화하거나 관련한 다양한 치료법에도 응용될 수 있을 것이다.